Electrophorèse bi-dimensionnelle quantitative (2D-DIGE)

Présentation

L’approche de l’élèctrophorèse bidimensionelle (2DE) permet d’avoir une cartographie du protéome d’un système biologique donné sous forme de spots. Une intéressante revue à consulter sur son intérêt toujours d’actualité !

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Schéma 2DE

L’intérêt de pouvoir comparer 2 protéomes du même système biologique dans différentes conditions est évident. Les problèmes de reproductibilité technique et expérimentale sont cependant multiples et ne permettaient pas de réaliser simplement une étude comparative et quantitative.

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2DE Comparative

Pour pallier aux fluctuations expérimentales et réaliser une 2DE quantitative, Amersham Bioscience a développé l’approche 2D DiGE qui a été mise en place à partir de 2005 à la suite des études préalables initiées par D.Payet, V.Asnafi et P.Ferrier. Résumé

Responsable

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Matthieu POPHILLAT

Principe

La technique Dige est basée sur l’utilisation de 3 fluorochromes (Cy-dyes : cy2 ; cy3 ; cy5) spectrallement differenciés et d’1 standard interne.

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principe DiGE

Chacun des extraits protéiques P à comparer est marqué respectivement avec le fluorochrome Cy3 ou Cy5. Un mélange contrôle (le standard interne) contenant un aliquot de tous les échantillons de l’expérience est marqué avec le Cy2. Après marquage, les 3 échantillons (P1-Cy3, P2-Cy5 et P1+P2-Cy2) sont mélangés, résolus sur un seul gel 2-D qui est alors numérisé suivant les 3 longueurs d’ondes des fluorochromes. Les images générées sont comparées et quantifiées par un logiciel approprié du type "DeCyder", "SameSpot" ou "Delta 2D". Aprés sélection, les protéines d’intérêt sont caractérisées par spectrométrie de masse.

Protocoles

1- Conception de l’expérience à mener.

Bien que la technologie DiGE permette de réduire un certains nombre de fluctuations expérimentales, il est nécessaire de respecter quelques règles afin de garantir sa validité.

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Conception d’une expèrience DiGE

Pour les échantillons : avoir un minimum de 4 répliquats biologiques, les répartir de façon aléatoire dans les gels et créer le standard interne adéquate. Dans le cas de prélèvements sur patients, la répliquation peut être impossible. Dans ce cas, envisager 2 expériences DiGE avec inversion des colorations.

Pour les Cydyes : utiliser le minimal labelling avec le Cy2 comme marqueur du standard interne et répartir les 2 autres dyes (Cy3 et Cy5) sur les 4 répliquats (inversion de dye).

2- Extraction des protéines.

La préparation des lysats protéiques est l’étape cruciale de la 2DE. Il est impératif de vérifier la qualité de chaque extrait -dégradation, contamination- (par mini gel 1DE ou mini gel 2DE) avant de lancer les 2DE-DiGE.

3- Dosage des protéines.

La qualité du dosage des extraits protéiques est importante car conditionne la validité de la quantification en DiGE (minimal labelling : seul 1 à 2% des groupements réactifs des lysines sont marqués et une trés faible part de chaque espèce protéique est marquée).

4- Marquage des protéines.

- Marquage DIGE :

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Marquage DiGE
  • Suivre les préconisations du livret fournis avec le kit.
  • Du fait de la fragilité des Dyes libres et de la capacité du DMF (N,N Diméthylformamide) à s’oxyder rapidement, il est préférable de regrouper plusieurs expérimentations Dige afin de réaliser un marquage simultané. 12 points pour chaque Dye avec le kit 5nmol.
  • Afin de visualiser d’éventuels effets dye et d’homogénéiser l’analyse, penser à répartir le marquage sur les différents types d’échantillons.
  • La conservation à -80°C après couplage ne pose pas de problème.

- Impératifs :

  • Concentration de l’échantillon entre 2.5 et 10mg/ml.
  • Pas d’agent réducteur.
  • Pas d’amines primaires.
  • Pas de détergents autre que le CHAPS.
  • pH du tampon de marquage à 8.5, pas en dessous.
  • Conserver le ratio quantité de Dye/quantité de protéine (400pmol/50µg avec un minimum validé par GE à 200pmol/25µg).
  • DMF : Ne pas le conserver plus de 3 mois.
  • Dyes reconstitués en solution stock : Ne pas les conserver plus de 1 mois.

5- Séparation des protéines.
- IEF : Première dimension.

  • Impératif : ne pas interférer sur la charge des protéines ; prévenir tout arc électrique.
    • Pas de SDS.
    • Sels : Tris 20mM maximum.

- SDS-PAGE : seconde dimension.

  • Impératif : charge des protéines homogène et négative.

6- Acquisition/numérisation des gels.
- Impératif : Les logiciels d’analyse nécessitent d’avoir des images en TIF 16bits.

  • Vérifier que la dynamique est utilisée sur une plage optimum au niveau des spots du gels et sur les 3 longueurs d’onde.
  • Dans le cas de l’utilisation de format propriétaire (autre que TIF, cas du ".gel" par exemple), toujours utiliser le même format entre les expériences.

- Scanner à caméra avec capteur CCD ou scanner avec laser et PMT ? Les capteurs CCD actuels sont largement à la hauteur, tout dépend de l’investissement et de l’utilisation escomptée.

  • Les scanners CCD :
    • Camera fixe
      • avec déplacement du gel (GE - EDI). La méthodologie d’acquisition est très bien adaptée à la Dige et aux gels 1D ou 2D.
      • acquisition de toute la surface du gel en une prise (Biorad - Versadoc ; Syngene - G-Box ; GE-AI 650 ; ). Ces appareils sont beaucoup moins performants de par leur conception et provoquent du vignetage. Ils n’offrent pas des résultats comparables aux scanners lasers.
    • Caméra mobile (Perkin Elmer - Proxpress).
  • Les "lasers" : dans tous les cas, un bras portant la tête optique pour l’excitation et l’émission se déplace. Fuji-GE - FLA 9000 ; GE- Typhoon.
    • Vérifier que le laser utilisé est assez énergétique pour exploiter au mieux la dynamique du fluorochrome. Les scanners à laser sont les plus versatiles et offrent une large plage d’utilisation spectrale.

7- Analyse quantitative.

Deux façons de travailler :
- Co-détection des spots dans chaque gel puis correspondance des spots dans les standards entre les différents gels : Decyder.
- Alignement des images des gels puis détection des spots : Samespot, Delta 2D.

La plateforme est équipé avec Decyder et Samespot.

8- Excision des spots.

Attention aux contaminations. L’utilisation d’un robot pour l’excision des spots est quasi incontournable : co-piquage des gels, coordonnées valides,....sinon la solution Screen Picker de Proteomics Consult est une bonne alternative.

9- Identification des spots.

La Journée des utilisateurs DiGE

Vous faites de la DiGE mais vous vous sentez isolé, vous avez des doutes sur l’application de cette technique à votre projet scientifique ou aux projets qui vous sont proposés ? Alors venez échanger et discuter avec les autres participants qui ont certainement été confrontés aux mêmes questions.

L’atelier DiGE

Un doute sur l’application de cette technique à votre projet scientifique ? Vous n’osez pas franchir le pas ? Venez tester par vous même ! Toutes les étapes depuis la préparation d’échantillon jusqu’à l’analyse d’images seront réalisées par les participants sur leur propre échantillons.

Equipements

EtapeAppareillagePhoto
- Première dimension : IPGPHOR III, Multiphor II ; financement CIML
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IPGphorIII
- Seconde dimension 1 : ProteanII XL multicell ; financement CIML
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Protean XL
- Seconde dimension 2 : Criterion Dodeca Cell ; financement CIML
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Criterion Dodeca Cell
- Acquisition d’image : Ettan DiGE Imager au CIML ; co-financement CIML/Cancéropole
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EDI
- Analyse d’image 1 : Decyder v7 ; financement Génopole
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Decyder 2D v6.5
- Analyse d’image 2 : Samespot v4 ; financement CIML
- Repique des spots : Manuelle après coloration au nitrate d’argent ou à l’"Imperial Protein Stain" , ou avec le robot 4 en 1 schimadzu Xcise ; co-financement CIML/CRCM/Région PACA/Conseil Général 13
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Xcise
- Identification des protéines : MALDI-TOF MS/MS, Ultraflex III ; co-financement INCa/Infectiopole Sud/Région PACA
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Ultraflex III

Résumé

Plateforme 2DE-DiGE

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2DE-DiGE

OralQcDige2007